1. 海腎熒光素酶

螢火蟲熒光素酶在氧氣,、ATP和鎂離子同時存在的條件下,，催化熒光素氧化,，生成氧化熒光素,，同時產(chǎn)生黃綠色光,，波長540-600nm。

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱,。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素,，在熒光素氧化的過程中,，會發(fā)出生物熒光。然后可以通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光,。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏,、高效地檢測基因的表達，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。

目前,，最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）,。

2. 海腎熒光素酶基因

1 熒光酶是一種酶,，能夠?qū)⒒瘜W能轉(zhuǎn)化為光能,，產(chǎn)生熒光現(xiàn)象。2 熒光酶的原理是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的技術(shù),，它可以將一種化學物質(zhì)的能量轉(zhuǎn)化為另一種化學物質(zhì)的熒光信號,，從而實現(xiàn)生物分子和細胞成像的目的,。3 熒光酶廣泛應(yīng)用于生物學領(lǐng)域,，例如基因工程,、蛋白質(zhì)表達,、細胞成像等,，是生物技術(shù)和醫(yī)學研究中不可或缺的重要工具。

3. 海腎熒光素酶質(zhì)粒

啟動子的預測 轉(zhuǎn)錄因子的預測 報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 實驗方法及結(jié)果分析 用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,。

設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段,，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。篩選陽性克隆,，測序,。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒,，提純備用,。同時準備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用,。培養(yǎng)293（或其它目的細胞）,，并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）,。將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞,。提取蛋白并用于熒光素酶檢測。加入底物,，測定熒光素酶的活性,。計算相對熒光強度，并與空載對照比較,。

4. 海腎熒光素酶報告基因

基因熒光檢測是一種自然發(fā)光反應(yīng),，通過熒光素酶與 ATP進行反應(yīng)，可檢測人體細胞,、細菌,、霉菌、食物殘渣,，在15秒鐘內(nèi)得到反應(yīng)結(jié)果,。

熒光檢測的主要缺點在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光,，但含有可衍生的官能團用于合成能發(fā)熒光的衍生物。

5. 海腎熒光素酶載體

pGRE-luc(報告基因質(zhì)粒)是用于檢測糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件(glucocorticoid response element, GRE)轉(zhuǎn)錄激

活水平的報告基因質(zhì)粒,。pGRE-luc是以pGL6質(zhì)粒為模板,，在其多克隆位點插入了多個GRE位點,，可以高靈敏度

地檢測GRE的激活水平，檢測糖皮質(zhì)激素介導的信號途徑(glucocorticoid-mediated signaling pathway)的激活水平,。

? pGL6質(zhì)粒是用于在哺乳動物細胞中進行螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)報告基因檢測的新一代質(zhì)粒,。該報告基因質(zhì)粒比

Promega公司的pGL3系列有了全面的改進，一方面對于luciferase的編碼進行了改進,，確保能更好地在哺乳動物細胞中進行

表達,，同時對整個質(zhì)粒中所有可以被預測出的可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點全部進行了適當?shù)耐蛔兲幚恚诒３衷泄δ懿?/p>

變的情況下,，使各種轉(zhuǎn)錄因子在質(zhì)粒上的非特異性結(jié)合降到最低